Tham khảo: Gopalakrishnan Venkatasami, John R. Sowa Jr. ∗ Department of Chemistry and Biochemistry, Seton Hall University, 400 South Orange Ave., South Orange, NJ 07079, USA

 NGUYÊN LÝ

Quá trình tách được thực hiện trên một cột C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt 5 µm). Pha động (0,1% Trifluoroacetic - TFA / methanol là 90:10) được bơm với tốc độ dòng 0.3 mL/ phút với bước sóng phát hiện ở 240 nm. Melamine tách ra ở 3,7 phút. Một đáp ứng tuyến tính (r> 0,999) quan sát thấy đối với các mẫu khác nhau từ 1,0-80  µgmL^-1 Phương pháp này cung cấp khả năng thu hồi từ 97,2-101,2%  trong khoảng nồng độ từ  5-40 µgmL^-1 . Các giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) có giá trị là 0,1 µgmL^-1 và 0,2 µgmL^-1

THÍ NGHIỆM

Hóa chất và thuốc thử

Chất chuẩn: Melamine (99,0%)

Dung môi: Methanol

Dung môi rửa giải: Trifluoroacetic và Methanol

Mẫu thử (sữa dạng bột hoặc lỏng, thức ăn chăn nuôi, thực phẩm,..)

Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động và pha loãng được lọc bằng hệ thống Q-pod Millipore.

Hệ thống sắc ký

Đầu dò UV, cột C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt 5 µm)

Thiết lập các thông số cho HPLC

Dung môi rửa giải HPLC là dung dịch 0,10% (pH 2.4) TFA / methanol (90:10) được bơm ở tốc độ dòng chảy của 0,3 mLmin^-1 với khối lượng tiêm 20 µL. Các bước sóng phát hiện được thiết lập tại 240 nm. Hiệu quả của TFA tập trung vào thời gian lưu giữ melamine và hình dạng pick được đánh giá. Tại 0,050% (pH 2,8) và 0,10% TFA, thời gian lưu giữ (3.7 phút) được hình dạng giống hệt nhau và cao điểm sắc nét, tuy nhiên, ở nồng độ 1,0% (pH 1,4) TFA, thời gian lưu giữ lâu hơn (4,6 phút) và pick rất rộng.

Pha dung dịch

Dung môi

Dung môi 50% methanol (về thể tích) được chuẩn bị bằng cách pha thể tích bằng nhau của methanol và nước.

Dung dịch chuẩn Melamine

Cân chính xác 100 mg melamine vào bình định mức 100 mL, hòa tan với Methanol 50% bằng cách rung trong bể rung siêu âm 30 phút. Lên thể tích 100 mL thu được dung dịch có nồng độ melamine 1000 µgmL^-1.

Pha loãng 5mL melamine trên (1000 µgmL^-1) bằng 50 ml 50% methanol để được nồng độ melamine 100 µgmL^-1.

Pha loãng tiếp 5mL melamine 100 µgmL^-1 bằng 50 ml methanol 50% để được nồng độ melamine 10 µgmL^-1.

Chuẩn bị mẫu

Cho 10 ml (mẫu dạng lỏng) hoặc 1,0 g (mẫu khô) vào bình định mức 100 ml. Mẫu được pha với 10 ml dung dịch  melamine của 1000 µgmL^-1, được pha loãng với 50 ml dung dịch methanol 50% và rung siêu âm 30 phút. Sau khi làm lạnh về nhiệt độ phòng, lên thể tích 100 ml bằng dung dịch methanol 50% và thu được dung dịch hỗn hợp với nồng độ melamine là 100 µgmL^-1

Cho dung dịch mẫu thu được vào ống li tâm và ly tâm ( ≥ 3200 rpm) rồi lấy phần dung dịch phía trên ống (5 ml) chuyển sang bình định mức 50ml, và lên thể tích 50 ml bằng dung dịch methanol 50%. Mẫu được lọc qua bộ lọc 0.45 µm (Acrodisc, 25mm, màng Nylon). Nghiên cứu về dịch lọc chỉ ra rằng các bộ lọc hấp thụ melamine tại các mức sau: 22% (cho 1ml ban đầu), 10% (2 mL), <1% (3, 5 và 7ml). Như vậy, 3ml ban đầu của dịch lọc bị loại bỏ phần lọc còn lại được bổ sung vào một lọ HPLC để phân tích.

Phương pháp kiểm chứng

Độ tuyến tính

Độ tuyến tính của dung dịch thử nghiệm đã được chuẩn bị từ dung dịch melamine ở các nồng độ khác nhau từ 1,0-80 µgmL^-1. Một đường cong hiệu chuẩn được thu được bằng cách vẽ đồ thị tuyến tính giữa diện tích peak với nồng độ. Giá trị % R.S.D (độ lệch chuẩn tương đối) từ năm lần tiêm mẫu chuẩn được lặp đi lặp lại ở mỗi nồng độ và %  hệ số độ lệch chuẩn đã được tính toán.

Hình 2. Mối quan hệ tuyến tính của nồng độ melamine với diện tích của peak

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOD và LOQ của phương pháp này được ước tính ở một tỉ số tín hiệu cực đại trên đọ nhiễu (Signal-to-noise) 03:01 và 10:01, bằng cách tiêm một loạt các dung dịch pha loãng với nồng độ nhất định.

Một nghiên cứu chính xác cũng đã được tiến hành ở mức LOQ bằng việc tiêm sáu lần riêng rẽ chất pha chế và giá trị % RSD của diện tích peak được tính toán. Một nghiên cứu về hiệu suất thu hồi được thực hiện trong ba lần, mức LOD và LOQ cho mẫu bột và chất lỏng cho thấy hiệu suất trung bình là 75 ± 2%  của LOD và 90 ± 1% của LOQ

Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp này được đánh giá ở nồng độ bốn mức độ melamine (5, 10, 20 và 40 µgmL^-1) với việc sử dụng 1 g khô hoặc10ml mẫu chất lỏng. Hiệu suất thu hồi phản ánh một trung bình cộng của sáu lần phân tích tại mỗi nồng độ và được báo cáo trong bảng 1.

Bảng 1: Kết quả phục hồi của melamine trung bình trong 6 lần phân tích ở 4 nồng độ khác nhau của Melamine

Độ chính xác được đo bằng độ ổn định và tính lặp lại của mẫu. Việc sử dụng một mẫu được xử lý theo mục 2.5.2, độ lặp lại trong 1 hay nhiều ngày của phương pháp đã được chứng minh bằng cách tiêm (trong ba lần) của mẫu vào ngày đầu tiên và ba ngày liên tiếp. Thu hồi khoảng 101,1-102,8 (0,8% RSD). Ngoài ra, độ tái lặp của một mẫu được xử lý (trong ba lần) một cách riêng biệt vào ngày 0 và ngày 4 có kết quả trong thu hồi 99,5 đến 101,8 (0,8% RSD).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sắc ký lỏng pha đảo là một kỹ thuật tách tuyệt vời cho các phân tử ion hóa. Vì melamine là một chất phân tích cơ bản (pKa = 5.0), trong điều kiện có tính acid (pH <3), chất phân tích được thêm đầy các proton trong pha động và các nhóm silanol (SiH₃OH) còn lại trên cột hỗ trợ Silica cũng được thêm proton. Phương pháp này sử dụng một hỗn hợp pha động của axit trifluoroacetic (0.10%, pH 2,4) và methanol. Phương pháp này là lợi thế hơn vì nó tránh việc sử dụng của acetonitril đắt tiền trong pha động.

Những sắc phổ (Hình 2) chỉ ra rằng không có sự nhiễu và các tín hiệu melamine được phân biệt rõ ràng ở 3,7 phút. Một đường cong hiệu chuẩn tuyến tính được thể hiện trong hình.3. Ngoài ra, các mẫu được pha với 5-40 µgmL^-1 Melamine chỉ ra sự thu hồi melamine khác nhau, từ 97,2-101,2 với các giá trị RSD khác nhau, từ 0,4% đến 2,9% cho thấy phương pháp này là chính xác trong khoảng nồng độ này (Bảng 1). Phương pháp này liên quan đến việc xử lý mẫu tương đối đơn giản bao gồm pha loãng với 50% Methanol. Sắc ký HPLC hoàn thành quá trình chạy trong 6 phút.

NHẬN XÉT

Tính chất tuyến tính

Một đường hiệu chỉnh tuyến tính (hình 3) thu được trên dải hiệu chuẩn từ 1,0 đến 80 µgmL^-1 với hệ số tương quan (r) 0,999. Giá trị R.S.D của các lần tiêm mẫu lặp lại < 0,02% đối với mỗi nồng độ và hệ số lệch chuẩn y < 2%

Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

LOD đã được xác định là 0,1 µgmL^-1 và LOQ đã được xác định là 0,2 µgmL^-1 . Giá trị % của R.S.D được nghiên cứu chính xác ở mức độ LOQ là trong khoảng 5%.

Độ chính xác

Hiệu suất thu hồi hồi tỷ lệ melamine trong các mẫu dao động từ 97,2% đến 101,2% (Bảng 1).

Phương pháp này cho thấy độ lặp lại trong 1 ngày và nhiều ngày cho các mẫu xử lý được chỉ ra thông qua hiệu suất thu hồi từ 101,1-102,8% (0,8% RSD). Ngoài ra, khả năng tái lặp của một mẫu riêng biệt xử lý (trong ba lần) vào ngày 0 và ngày 4 kết quả hiệu suất thu hồi từ 99,5-101,8 (0,8% RSD).

KẾT LUẬN

Bài viết này mô tả một phương pháp đơn giản để xác định ô nhiễm melamine trong các thực phẩm và thức ăn chăn nuôi bằng cách sử dụng sắc ký lỏng pha đảo HPLC. Phương pháp này thuận lợi bởi vì pha động là acetonitril miễn phí và thời gian phân tích của ~ 6min mỗi mẫu. Quá trình tách được thực hiện trên cột C18 (150mm x 3.2mm ID, kích thước hạt 5 µm) ở nhiệt độ phòng với một pha động của TFA 0,1% / methanol (90:10), tốc độ dòng chảy của 0.3 mLmin^-1 và phát hiện ở bước sóng 240 nm của đầu dò. Bắt đầu với một nồng độ chất phân tích của 10 µgmL^-1, một phản ứng tuyến tính(r> 0,999) đã được quan sát thấy đối với các mẫu khác nhau, nồng độ từ 10%  đến 400%. Phương pháp này cho hiệu suất thu hồi 97,2-101,2% trong khoảng nồng độ 5-40 µgmL^-1 . Trong ngày và giữa các ngày tính lặp lại là ít hơn 1,0% R.S.D. LOD và LOQ là 0.1 mLmin^-1 và 0,2 mLmin^-1, tương ứng. Phương pháp phân tích này cung cấp độ nhạy cảm tuyệt vời, khả năng tái lặp, chính xác cao.