Tìm hiểu một số phương pháp xác định protein và các enzim trong sản phẩm nông nghiệp

Khoảng 95% cơ thể và các bộ phận của sinh vật được xây dựng từ carbon, hydro, oxy và nitơ và 5% còn lại chứa các yếu tố khác, bao gồm cả những chất cần thiết và không cần thiết. Cấu trúc của phân tích thực phẩm hóa học theo phân loại cổ điển của các thành phần hóa học dựa trên các nhóm dinh dưỡng của hợp chất (Hình 8). Các thành phần với nồng độ cao nhất trong các sinh vật sống là nước; (khoảng 70 đến 90% tổng khối lượng). Hàm lượng nước của các mô giảm theo độ tuổi. Chất khô có thể được phân loại thành các nhóm vô cơ và hữu cơ; trong trường hợp một sản phẩm nông nghiệp một phần quan trọng của chất tro bắt nguồn từ nhiễm bẩn vô cơ. Phân tích xác định giá trị dinh dưỡng của thức ăn và thực phẩm là việc xác định hàm lượng chất khô bằng phương pháp bay hơi (lượng nước được tính từ nó); hàm lượng nitơ bằng các phương pháp tiêu hóa hoặc đốt và protein được tính từ giá trị này; hàm lượng chất béo bằng phương pháp khai thác và hàm lượng chất xơ bằng phương pháp tiêu hóa. Phần còn lại là carbohydrate, axit hữu cơ, bột màu, chất chống oxy hóa và các hợp chất khác. Những yêu cầu của hiện nay trên phân tích thực phẩm cho thấy sự quan tâm hơn về các thành phần và định giá đầy đủ về chất lượng dinh dưỡng đòi hỏi kiến ​​thức về vai trò, số liệu và các nguyên tắc của phương pháp phân tích của chúng.

Hình 8: Thành phần của một mẫu thức ăn hoặc thức ăn chăn nuôi

Các hợp chất chứa nitơ

Các hàm lượng nitơ có thể có mặt trong các dạng hữu cơ và vô cơ. Tỷ lệ các dạng hữu cơ và vô cơ là phụ thuộc vào sản phẩm, ví dụ hơn 95% nitơ ở dạng hữu cơ trong hạt ngũ cốc, nhưng nó có thể làm giảm trên 50% đối với rau. Vai trò của các hình thức hữu cơ cao hơn nhiều về dinh dưỡng và sự hiện diện của các hình thức vô cơ với số lượng lớn có thể gây hại (ví dụ nitrat).

Các axit amin, các hợp chất nitơ hữu cơ nhỏ nhất trong các sản phẩm nông nghiệp hình thành chuỗi axit amin và protein. Các thuộc tính (chức năng, giá trị dinh dưỡng) của các protein được xác định bởi các thành phần acid amin và cấu trúc của polypeptide. Căn cứ vào hình thức của chúng, protein hình cầu (như albumin và protamines) và các protein dạng sợi (ví dụ myosin, collagen) có thể được xác định. Căn cứ vào chức năng sinh học của chúng, gồm có protein kết cấu, lưu trữ, vận chuyển, phòng thủ, co bóp và protein điều hòa có thể được liệt kê. protein đơn giản có chứa các axit amin chỉ trong khi những thành phần liên hợp cũng chứa các tiểu đơn vị khác; ví dụ. chromoproteins chứa Fe-ion (ví dụ hemoglobin), metalloproteins chứa các ion kim loại khác (enzyme khác nhau) và lipoprotein chứa nhóm lipid (cholesterol).

Phân tích các protein đơn giản có thể được phân loại theo độ hòa tan. Các albumin là phần dễ hòa tan nhất; chúng có thể hòa tan trong dung dịch nước, nước muối, axit và kiềm cất, có mặt trong hầu hết các sản phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật (máu, hạt cây, trứng). Các globulin không tan trong nước nhưng mặn, chua và các giải pháp alcaline họ có thể hoà tan (huyết thanh và mô, globulin). Các prolamines không tan trong nước và nước muối và dung dịch cồn nước 60-90%, nhưng không hòa tan trong nước tập trung hoặc rượu. Chúng là những điển hình cho loại hạt ngũ cốc. Các glutelins kháng hầu hết các dung môi; chỉ các dung dịch kiềm và axit loãng có thể tan chúng. Chúng được tìm thấy trong thực vật, đặc biệt là trong các hạt ngũ cốc như protein lưu trữ. Các scleroproteins đề kháng với các dung môi; chúng có mặt trong số lượng nhỏ như protein cấu trúc và có thể được destructed bởi cách enzym.

Việc xác định hàm lượng protein có thể được trực tiếp với các phép đo trực tiếp của các protein trong ma trận mẫu hoặc gián tiếp, khi hàm lượng nitơ được xác định và nó được sử dụng trong các công thức để tính toán. Các phương pháp trực tiếp là chuẩn độ và quang phổ. Các cơ sở của phương pháp chuẩn độ formol là nhóm amin trong dung dịch protein có chứa trung hòa phản ứng với formaldehyde. Phản ứng này có thể được điều chỉnh bằng natri hydroxit. Các phương pháp quang phổ thực tế sử dụng được là tia cực tím và quang phổ của ánh sáng nhìn thấy được. Các phản ứng biuret trong môi trường kiềm không liên kết ion đồng với bốn nguyên tử nitơ tạo phức màu tím có thể được xác định ở vùng bước sóng 540-560 nm được sử dụng rộng rãi nhất (phương pháp Lowry).

Các phương pháp gián tiếp dựa trên hàm lượng nitơ của mẫu. Mặc dù các protein có chứa hàm lượng nitơ 16% trên trung bình, các loại khác nhau của các protein có hàm lượng nitơ khác nhau, ví dụ, hàm lượng nitơ của sữa và sản phẩm sữa là 15,67% (do đó hàm lượng nitơ cần được nhân 6.38), giá trị này cho ngô, đậu, đậu và thịt là 16.00 (hệ số: 6,25), cho hạt lúa mì và bột mì 17,15 và 17,54 (hệ số: 5,83 và 5,70), tương ứng, và 18,31 (hệ số: 5.46) cho hạt, do đó các kiến ​​thức về tỷ lệ nitơ đúng là điều cần thiết cho kết quả đầy đủ. Mặt khác, tính chính xác của kết quả phụ thuộc vào phương pháp áp dụng để xác định hàm lượng nitơ. Các phương pháp Dumas đo tổng hàm lượng nitơ của mẫu bất kể đến hình thức của nó. Các phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng nitơ protein, peptide, acid amin, amit và amoniac, chỉ có dạng vô cơ bị oxy hóa được loại trừ. Các phân tích axit amin (AA-N) xác định số lượng các axit amin tự do và bị chặn và phương pháp Barnstein đo lượng peptide và polypeptide chỉ (Hình 9). Khi các giá trị tính toán được chứa dạng nitơ khác nhau với protein, tên phân tích tham số này là hàm lượng protein thô.

Hình 9: So sánh các phương pháp để xác định hàm lượng nitơ

Các phương pháp Dumas hoặc đốt xác định lượng phân tử nitơ. Đối với điều này, các nitơ có chứa hợp chất của mẫu được đốt ở nhiệt độ cao (850-1.050 ° C) trong sự hiện diện của oxy và bạch kim chất xúc tác và các hình thức oxit nitơ. Bước tiếp theo là giảm các oxit nitơ tiểu khí trên đồng hoặc vonfram. sản phẩm khí này có phải được làm sạch từ khí liên quan bằng chất hấp thụ và đo bằng cách đo khối lượng hoặc các tế bào dẫn nhiệt. Ưu điểm của phương pháp Dumas là sự đơn giản, nhanh hơn nhiều so với phương pháp Kjeldahl và chỉ sử dụng một số lượng nhỏ và khối lượng hóa chất, nhưng nó đòi hỏi vốn đầu tư cao và lượng nhỏ mẫu, do đó bất cập xảy ra đối với hàm lượng nitơ nhỏ.

Các phương pháp Kjeldahl là phương pháp phổ biến nhất để đo hàm lượng protein thô. Đầu tiên, các chất hữu cơ được tiêu hóa bằng cách đun nóng với axit sulfuric, tạo ra amoni hydrogen sulfate. Bước tiếp theo là phiên bản của nitơ; thêm một dư thừa của (NaOH) chuyển đổi nó thành amoniac. Các giải pháp được đun sôi và amoniac khí phát hành được ngưng tụ trong một acid nhận (acid sulfuric hoặc acid boric), trong đó hàm lượng nitơ được xác định bằng cách chuẩn độ (NaOH hoặc axit sunfuric). Phương pháp này được quốc tế công nhận, tiêu chuẩn hóa và được chấp thuận, đáng tin cậy, nhưng tiêu thụ tương đối thời gian và hóa chất nguy hiểm được yêu cầu.

Phương pháp xác định hàm lượng protein thực là phương pháp Barnstein. Đầu tiên, hàm lượng nitơ phi protein (ammonia, amids, vv) được tách ra bởi sự kết tủa của protein thực sử dụng đồng sunfat hoặc natri hydroxit. kết tủa này có phải được làm sạch từ các hình thức N phi protein hòa tan bằng cách lọc và rửa trôi bởi nước nhiều lần. Kết quả là, lượng chỉ chứa hàm lượng nitơ của các protein và peptide và các phương pháp Kjeldahl hay Dumas có thể được áp dụng cho xác định hàm lượng nitơ của nó. Ưu điểm của phương pháp này là việc áp dụng phương pháp này sẽ dẫn đến những phát hiện chính xác nhất về hàm lượng protein, nhưng nhược điểm là tương tự như phương pháp Kjeldahl.

Hàm lượng protein tiêu hóa có thể được xác định bởi trong ống nghiệm thủy phân bằng pepsin, pepsin-trypsin, pancreatin hoặc xử lý enzyme kết hợp. Sau khi xử lý sơ bộ, các mẫu được xử lý với enzyme hay men ủ ở nhiệt độ quy định cho thời gian cần thiết. Định lượng protein khả năng hòa tan có thể được thực hiện bằng phương pháp Kjeldahl hay phân tích axit amin.

Có một số phương pháp khác để xác định hàm lượng protein. Bên cạnh phương pháp quang phổ UV và quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng rộng rãi. Các phương pháp khác, chẳng hạn như đo chiết quang, phân cực, phương pháp đo độ đục và phương pháp huỳnh quang kế cũng được sử dụng cho các mục đích đặc biệt, nhưng tầm quan trọng thực tế của chúng là rất nhỏ.

Việc đánh giá thành phần protein của mẫu cũng rất quan trọng để đánh giá giá trị dinh dưỡng. Việc xác định được dựa trên việc tách các tiểu đơn vị lớn hoặc nhỏ của protein hoặc phân tích các thành phần acid amin. phương pháp đơn giản tương đối là kết tủa đẳng điện dựa trên thực tế rằng các protein khác nhau có điểm đẳng điện khác nhau. Việc điều chỉnh pH đến giá trị cụ thể sẽ xác định những protein phân kết tủa và những gì còn lại trong dung dịch. Các phương pháp khác đòi hỏi cụ phân tích đầu tư cao và chi phí hoạt động và phân tích chuyên nghiệp.

Các phương pháp hấp phụ (trao đổi ion sắc ký, sắc ký ái lực) là cột và phương pháp sắc ký lỏng cao áp, khi mẫu đã chuẩn bị được chuyển qua một giai đoạn vật liệu hấp thụ rắn có chọn lọc và ái lực hấp phụ-giải hấp của protein sẽ xác định các ràng buộc của chúng. Các điện sử dụng sự khác biệt về kích cỡ và chuyển động của các protein trong một điện trường với pH hoặc một gradient pH (ví dụ đẳng điện tập trung). sự khác biệt kích thước cũng có thể là cơ sở tách ra; lọc máu, siêu lọc và sắc ký loại trừ kích thước cũng rất thích hợp cho việc tách các protein với các kích cỡ khác nhau. Các phân tích axit amin là xác định các axit amin duy nhất trong mẫu. Các axit amin của protein phải được phân cách bằng thủy phân sau đó chúng có thể được đánh giá bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao. Một số axit amin có thể được phân tích bằng phương pháp trắc quang (ví dụ methionine, cystine, tryptophan).